CAR-T介导免疫抑制性肿瘤细胞的耗损以增强抗肿瘤免疫反应和过继性免疫反应

肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associated macrophages，TAMs）是免疫抑制性肿瘤细胞微环境（Immunosuppressive tumor microenvironment，TME）中主要的成分，包括两大类的巨噬细胞，M1和M2型巨噬细胞。其中M2型占大多数，这些巨噬细胞通过分泌生长因子、基质降解酶和促血管生成因子等多种机制支持肿瘤生长。此外，还通过产生一系列抗炎细胞因子(如IL-10)和消耗T细胞功能所必需氨基酸的酶(如Arginase 1)抑制免疫细胞，或通过表达抑制性免疫检查点配体(如PDL1)等多种方式促进肿瘤的生长。而M1型巨噬细胞的功能与M2型相反，它可以抑制肿瘤的生长，协同其他免疫细胞发挥抗肿瘤的免疫功能。基于此，在TME中对TAMs重编程，是一种有效抗肿瘤策略。

目前包括CAR-T在内的新一代治疗策略可对TME进行重新编程。相较于常规性的直接靶向肿瘤细胞的CAR-T疗法，新一代CAR-T则是靶向TME中的非肿瘤成分，间接地限制了肿瘤的发生发展。

今年Daniel J. Powell Jr团队在Nature Communications上发表了一篇题为“CAR-T cell-mediated depletion of immunosuppressive tumor-associated macrophages promotes endogenous antitumor immunity and augments adoptive immunotherapy”的文章。该研究团队主要利用CAR-T耗尽FRβ⁺TAMs（表达FRβ的TAMs亚群具有M2型巨噬细胞表型和功能），最终导致TME的重编程，促进内源性T细胞介导的抗肿瘤作用。

FRβ（叶酸受体β）是一种在急性髓样白血病细胞中表达的糖磷脂酰肌醇锚定的受体，目前已成为CAR-T细胞疗法的肿瘤抗原靶标。该研究团队首先验证了卵巢癌组织中FRβ的表达，发现当肿瘤生长到有腹水形成时，FRβ⁺TAMs亚群占到了巨噬细胞总数的52.14 ± 11.42%，并且FRβ⁺TAMs亚群并不是一个静止的状态，而是一个随着肿瘤生长不断增加的亚群；此外，正常小鼠的巨噬细胞在肿瘤细胞培养上清中培养24h，其FRβ的表达也明显增加。

之后，该研究团队利用免疫荧光进一步证实了FRβ⁺TAMs形态与M2型巨噬细胞一致，FRβ^–TAMs形态与M1型巨噬细胞一致。此外，FRβ⁺TAMs表面高表达CD204，CD206和CD163，与M2表型基本一致。采用多重细胞因子分析法发现FRβ^–TAMs分泌IL-6，IL-27，IL-17α，TNF-α，IFN-β和GM-CSF的能力高于FRβ⁺TAMs；而FRβ⁺TAMs高分泌IL-10。并且这种能力在LPS的刺激下可进一步增强。

接着，该研究团队验证了具有M2表型的FRβ⁺TAMs对T细胞的抑制作用。利用小鼠特异性人间皮素(hMeso)的CAR-T 细胞建立了抗原特异性T细胞反应模型。用细胞示踪染料标记hMeso CAR-T细胞，并与工程化的ID8.hMeso细胞共培养，在共培养初期加入分选的 FRβ⁺或FRβ^–TAMs。结果发现，在FRβ⁺TAMs存在下，hMeso CAR-T的增殖及分泌IFN-γ的能力明显低于加入FRβ^–TAMs的情况。

CAR-T细胞疗法已经介导了针对不同抗原的某些类型的癌症的完全缓解。基于此，该研究团队构建了针对FRβ靶点的CAR-T。之后，研究团队从负荷ID8肿瘤的Folr2 wt和Folr2-/-(敲除FRβ基因)小鼠的腹水中分离CD11b⁺细胞与构建好的CAR-T体外共培养。结果显示，mFRβ CAR-T与Folr2 wt小鼠的TAMs共培养时才能分泌更高水平的IFN-γ和更强的诱导靶细胞裂解的能力。

然后，研究团队在ID8小鼠模型中进一步验证了mFRβ CAR-T的作用。发现mFRβ CAR-T细胞导致FRβ⁺TAMs的耗竭，TME中招募大量的免疫细胞，包括CD11b⁺细胞和CD8⁺T细胞。而内源性肿瘤特异性CD8⁺T细胞的大量涌入，最终抑制了肿瘤的生长并延长了生存时间。

同样的，通过FRβ特异性CAR-T细胞对TME进行预处理也可以提高肿瘤导向性的抗间皮素CAR-T细胞的效果，而同时使用以上两种CAR-T细胞则不能产生相应的效果。接着，研究团队研究了mFRβ CAR-T联合传统靶向肿瘤的CAR-T疗法是否能够增强抗肿瘤效果。为此，在C57BL/6小鼠接种ID8.hMeso肿瘤细胞，21天后，将小鼠随机分成4组（hCD19，mFRβ，hMeso以及mFRβ⁺hMeso CAR-T）。发现两种CAR-T联合使用并不能提高抗肿瘤效果；而事先通过mFRβ CAR-T细胞对TME进行预处理后，可以提高肿瘤特异性的hMeso CAR-T细胞的效果，延长小鼠的生存期。此外，利用mFRβ CAR-T预处理后，可以增强小鼠血液中hMeso CAR-T的浓度。

之后，该研究团队检测了临床肿瘤样本中FRβ⁺TAMs，发现几乎所有的肿瘤组织中都存在高比例的FRβ⁺TAMs，并且FRβ和CD206，CD163共表达，这与在小鼠中发现的类似。此外，采用磁珠法从人腹水中分离 CD11b⁺细胞，与不同的CAR-T共培养，发现在hFRβ CAR-T 细胞中观察到抗原特异性IFN-γ 的产生和 CD11b⁺ 细胞(含FRβ⁺TAMs)的特异性溶解。这为建立CAR-T靶向hFRβ TAMs提供了可行性。最后，为了探讨FRβ 在卵巢癌患者中的临床意义，该研究团队研究了FRβ 基因的表达与无进展生存期(PFS)的相关性。发现，虽然在卵巢癌早期(Ⅰ和Ⅱ期)患者中没有观察到明显的相关性，但是在Ⅲ期和 Ⅳ期表达高 FOLR2的患者与表达低的患者相比，中位生存期明显缩短。并且在其他肿瘤患者中也显示相同的结果。这揭示了重要的预后价值，同时也支持了靶向表达FRβ 免疫抑制性巨噬细胞在癌症患者中的潜在益处。

综上，该研究团队开发了一种针对TAMs的CAR-T，可以将TME重编程为一个促进抗肿瘤免疫反应和限制肿瘤进展的TME，提高其他免疫疗法的疗效，包括CAR-T细胞疗法。以前的研究主要是用单克隆抗体或者小分子药物来靶向TAMs，然而这种策略需要持续给药，以防止巨噬细胞再次的增殖，并且也容易发生全身性细胞毒性；而FRβ CAR-T具有增殖能力，能够在较长时间存在，并且安全性也是比较好的。总之，利用CAR-T靶向免疫抑制性细胞是一种非常有潜力的治疗方法。