近期研究表明溶瘤病毒（OV）正在成为免疫原性细胞死亡（ICD）的有效诱导剂，其在感染癌细胞后可激活固有免疫细胞，引起固有免疫应答，释放出有效抗癌免疫的内源性分子（DAMP），诱导有效的抗癌免疫。溶瘤新城疫病毒（NDV）在胶质瘤细胞和肺癌细胞中均能产生ICD。ICD的特征是损伤相关分子模式（DAMP）、OV衍生病原体相关分子模式（PAMP）分子和炎性细胞因子的分泌、释放或表面暴露。
在已完成第一期/第二期临床试验的OVs中，新城疫病毒（NDV）是一种禽副粘病毒，作为晚期癌症患者的溶瘤剂，已取得不错疗效，此外，溶瘤NDV通过诱导ICD在原位胶质瘤中触发肿瘤特异性免疫记忆。来自上海的邵晓燕团队最近报告了一株溶瘤NDV菌株FMW（此处为NDV/FMW）是肺癌细胞中有效的ICD诱导剂。在本研究中，研究人员的目的是探讨NDV／FMW是否诱导黑色素瘤细胞ICD及其调控途径。作者发现，NDV/FMW在培养的黑色素瘤细胞和小鼠模型中都能触发ICD，且可以通过靶向信号转导子和转录激活子3（STAT3）来调节。
为了探讨NDV／FMW是否能在黑色素瘤细胞中引发ICD，该研究团队首先检测NDV／FMW是否能在黑色素瘤细胞中复制并引发胞死亡。与作者之前在肺癌和甲状腺癌细胞中的研究结果一致，NDV /FMW在人类黑色素瘤A375和C8161细胞中能大量复制，表现为病毒滴度升高和NDV血凝素神经氨酸酶蛋白（HN）的表达上调。鉴于溶瘤NDV在胶质瘤和肺癌细胞中触发ICD，该团队假设NDV /FMW会在黑色素瘤细胞中诱导ICD。为了验证这一假设，该团队测量了病毒感染后上清液中的ICD标记物ATP、HMGB1和HSP70/90的含量，并检查了受感染黑色素瘤细胞的细胞表面CRT表达（外CRT）。选择米托蒽醌（MTX）治疗作为阳性对照，如图1A所示，与模拟感染细胞相比，NDV/FMW感染的A375和C8161细胞的共焦成像显示，在感染后24和48（hpi），细胞表面CRT（红色）的暴露增加。
正如预期的那样，MTX治疗在两种黑色素瘤细胞系中都诱导了CRT的强烈暴露。此外，流式细胞术分析进一步证实了NDV/FMW感染诱导的A375和C8161细胞CRT暴露（图1B）。为了检测NDV感染的黑色素瘤细胞中的分泌性DAMP，收集细胞培养基并在24和48 hpi下浓缩。ELISA法检测ATP分泌和HMGB1释放，免疫印迹法检测其他释放的DAMP。如图1C、E所示，经ELISA测定，在24小时或48小时感染A375和C8161细胞系的NDV/FMW分别导致细胞外ATP和HMGB1的增加。此外，在48 hpi时，在感染NDV/FMW的A375和C8161细胞系的浓缩上清液中检测到HMGB1和HSP70/90蛋白水平显著升高（图1D）。
ICD的发生率通常被认为与细胞凋亡、自噬、程序性坏死或内质网应激密切相关。作者之前的研究表明，自噬而非凋亡或坏死有助于NDV介导诱导的肺癌细胞ICD。在黑色素瘤细胞中检测细胞凋亡、自噬、坏死或内质网应激可能在NDV/FMW触发的ICD中发挥作用，研究人员分别用泛半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂Z-VAD-FMK（Z-VAD）、自噬抑制剂氯喹（CQ）、坏死抑制剂Necrostain-1（Nec1）和内质网应激抑制剂GSK2606414（GSK）预处理细胞。图2A显示，与单独使用病毒处理的细胞相比，受试的四种抑制剂均有效减缓了暴露于NDV/FMW的A375细胞中HMGB1和HSP70/90的释放。在C8161细胞中获得了与A375细胞相似的结果（图2C）。此外，为了评估凋亡、自噬、坏死或内质网应激抑制剂对新城疫病毒/FMW诱导的细胞死亡的影响，图2B、D显示了台盼蓝试验的细胞死亡率（图2B、D）。
JAK-STAT3信号在抗癌免疫治疗和白细胞介素-6（IL-6）介导的肿瘤进展效应等细胞因子中起着关键作用。因此，该团队假设STAT3可能在黑色素瘤细胞中NDV诱导的ICD中发挥作用。为了验证这一点，该团队首先检测了黑色素瘤细胞中STAT3（Y705处STAT3的酪氨酸磷酸化）对NDV/FMW感染的反应。如图3A所示，NDV/FMW感染A375和C8161细胞导致48 hpi时pSTAT3（Y705）显著下降。Mcl-1和Bcl-xl是两个已知的STAT3靶基因，在感染细胞中持续下调（图3A）。接下来，该团队研究了抑制STAT3对黑色素瘤细胞中NDV／FMW复制和细胞死亡的影响。
为了实现这一目标，该团队在实验中使用了C188-9，这是一种在晚期癌症早期临床试验（NCT03195699）中评估过的特异性STAT3抑制剂，并验证了其疗效通过降低STAT3的磷酸化水平。作者观察到，在48 hpi下，用C188-9预处理明显拮抗NDV/FMW感染诱导的A375和C8161细胞PARP裂解、p62减少和eIF2α磷酸化（图3B）。值得注意的是，C188-9治疗降低了感染黑色素瘤细胞中NDV蛋白HN的蛋白水平（图3B），表明抑制STAT3可能会减少黑色素瘤细胞中NDV/FMW的复制。
在证明STAT3的药理学抑制会影响NDV/FMW介导的黑色素瘤细胞死亡后，作者提出抑制STAT3是否会对NDV/FMW诱导的ICD标记物产生影响。如图4A、B所示，分别通过共聚焦成像和流式细胞术测定，用C188-9预处理减少了A375和C8161细胞中NDV/FMW感染引起的CRT暴露。此外，通过免疫印迹和ELISA检测，暴露于C188-9可减少NDV感染后A375和C8161细胞中HMGB1、HSP70和HSP90的ATP分泌和释放（图4C-E）。有趣的是，IL-6预处理增强了NDV/FMW处理的A375细胞和C8161细胞中HSP90的释放（图4C）。此外，与单独的病毒感染相比，C188-9治疗降低了NDV/FMW感染细胞的病毒产量，而IL-6处理提高了A375细胞和C8161细胞的病毒滴度（图4F）。
为了排除C188-9可能的脱靶效应，研究人员用慢病毒介导的靶向STAT3的shRNA在A375和C8161细胞中稳定地敲除STAT3。通过免疫印迹试验证实了敲除的结果（图5A）。这与C188-9对NDV/FMW介导的黑色素瘤细胞死亡的影响一致，STAT3缺失也降低了NDV/FMW诱导的PARP裂解和eIF2α磷酸化（图5B）。值得注意的是，与对照shRNA处理的A375细胞相比，STAT3缺失的A375细胞中ICD标记物的诱导（包括CRT暴露、ATP分泌、HMGB1以及NDV感染时HSP70/90的释放）严重减弱（图5C-F）。这在C8161细胞中获得了类似的结果（图5C–F）。
该团队之前的研究表明，NDV感染的肺癌细胞上清液在体内抑制肿瘤生长。为了研究NDV感染的黑色素瘤细胞上清液是否能抑制体内黑色素瘤的生长，研究人员收集并浓缩了上清液并用紫外线照射以灭活病毒。A375肿瘤模型小鼠瘤内注射NDV /FMW，或浓缩上清液或空白对照。如图6A所示，与空白对照的肿瘤相比，上清液显著抑制了黑色素瘤的生长。正如预期的那样，NDV/FMW注射显著降低了肿瘤生长（图6A）。此外，与瘤内注射PBS的小鼠相比，瘤内注射浓缩上清液明显延长了A375肿瘤模型小鼠的存活时间（图6B）。
该团队的研究表明并证明，溶瘤NDV \ FMV病毒能刺激黑色素瘤细胞中ICD印记的表达和释放。除此之外，该团队还验证了细胞死亡的多样性，这在很大程度上进一步促进了NDV/FMV诱导的ICD标记物的释放。值得注意的是，转录因子STAT3在暴露于NDV /FMW的黑色素瘤细胞中诱导ICD中起着关键作用。
文章来源：https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fonc.2019.00436/full