根据以往研究发现溶瘤病毒(OVs)能够对肿瘤微环境(TME)有一定的激活作用，并引起浸润性肿瘤特异性T细胞的免疫反应。然而，OVs治疗对肿瘤中的肿瘤免疫检查点起了负面影响，减弱了抗肿瘤免疫反应。因此，开发新的策略来最大限度地发挥OVs的潜力迫在眉睫。溶瘤病毒 (OVs) 在癌症治疗中有出色的临床疗效，然而，仅有几种癌症类型得到改善[1]。
首先，OVs 的内部传播受到肿瘤异质性和宿主抗病毒免疫反应的限制，而病毒在肿瘤内的有效复制和传播需要更强大的 OVs。其次，肿瘤微环境 (TME) 通常包含免疫抑制因子，要逆转这种负面的癌症免疫设定点，需要更合适的免疫调节剂的组合来进行治疗[2]。PD-1是淋巴细胞上的一种抑制受体，肿瘤通过抑制性配体程序性死亡配体1(PD-L1)逃避T细胞反应[3]。
作者前期研究表明，癌细胞上的配体PD-L1在溶瘤病毒治疗的肿瘤内被上调。除了PD-1外，TME中还有多种其他的免疫抑制通路参与。免疫检查点分子，如细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)、T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域蛋白3(TIM-3)等经常在肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)上过表达，导致活化的CD8+T细胞耗竭[4]。因此，OVs联合免疫检查点抑制剂可以进一步增强TME中的T细胞效应功能，改善抗肿瘤免疫反应，成为一种很有前景的免疫治疗策略[5]。本文作者通过将一个人源化的hPD-1阻断剂基因(hPD-1)插入到亲本OVH基因组中，构建了一种溶瘤性单纯疱疹病毒1型(HSV-1)病毒YST-OVH。
首先，作者评估了OVH的抗肿瘤疗效。作者使用了C57BL/6鼠，皮下注射 Hepa1-6（5×106）肿瘤细胞，肿瘤达到250mm3时瘤内注射OVH（107 PFU）进行治疗。OVH治疗通过增强T细胞的募集显著抑制了肿瘤的生长，但它同时增加了PD-1的表达，从而阻碍了细胞毒性T细胞的抗癌作用，并不能达到完全根除肿瘤的效果（图1A-C）。因此，作者结合OVH病毒治疗和抗PD-1免疫治疗来弥补它们各自的弱点。在Hepa1-6肿瘤模型中，抗PD-1抗体（200μg）和OVH的联合使用不仅根除了病毒注射的肿瘤，而且还根除了远处肿瘤，且无复发(图1D-G)。作者还分析了参与联合治疗的关键免疫细胞，发现 CD8+ T 细胞在对联合治疗的反应中起主要作用，并且可能需要巨噬细胞和NK细胞的参与（图1H-1K）。这些结果表明，联合 OVH 和抗 PD-1抗体 疗法可以克服免疫抑制性 TME 对免疫疗法的耐药，从而增强抗癌作用。
PD-1的阻断加上病毒联合疗法具有治疗癌症的潜力，因此，当前的首要任务是构建一个能识别hPD-1的人源化抗体的OV，从而进一步进行临床研究。作者通过筛选和构建，获得了一种人源化单克隆抗体hu17D5（抗PD-1抗体），并基于hu17D5的基因序列，构建了hPD-1scFv，其结合活性高于市售的抗PD-1抗体派姆单抗(PEM)和尼鲁单抗(NIV)(图2A-F)。随后，作者构建了一个新的OV，序列中含有hPD-1scFV基因的OV被命名为YST-OVH(图2G)。检测YST-OVH感染的细胞上清中hPD-1scFv蛋白的表达时间依赖性上升，72h到达峰值。该病毒与亲本病毒在癌细胞中的复制效率相似；并能提高对T细胞激活活性以及恢复淋巴细胞的功能(图2H-L)。值得一提的是，通过构建的人源化(PD-1-hu)转基因小鼠可以很好地评估OV和hPD-1scFv诱导的抗肿瘤免疫反应，因为hPD-1scFv蛋白不能与mPD-1结合，因此在常规小鼠中没有活性。在PD-1-HU小鼠建立的Pepa-1-6肿瘤携带模型中验证了hPD-1scFv有良好的抗肿瘤效果(图2M)。
随后作者比较了YST-OVH和OVH诱导的溶瘤作用，其对多种肿瘤细胞具有杀伤作用，且感染剂量与肿瘤细胞杀伤能力呈正相关(图3A-B)。为了进一步评估YST-OVH在体内的肿瘤细胞杀伤能力，作者在Hep3B和A549的皮下移植模型小鼠中进行评估，结果观察到类似的肿瘤抑制作用(图3C-F)。然后，作者又建立了小鼠Hepa1-6癌细胞的双侧肿瘤模型。给药后能够使两侧肿瘤完全消退，且OVH治疗小鼠和YST-OVH治疗小鼠之间没有明显的疗效差异(图3G-J)。以上这些结果表明 YST-OVH在多种类型的肿瘤中复制，并且显示出良好的溶瘤作用。
作者通过将表达萤火虫荧光素酶基因的Hepa1-6细胞肝内注射到PD-1-HU小鼠体内，建立原位肿瘤模型，并比较静脉注射YST-OVH与OVH的效果。与其他两组相比， YST-OVH 治疗组显著抑制了小鼠肿瘤生长并增加了总生存时间（图 4A-D）。随后作者通过皮下注射Hepa1-6 细胞建立了PD-1-HU 小鼠的双侧肿瘤模型，以比较 YST-OVH 与 OVH在瘤内注射的药效。结果发现，YST-OVH治疗组比OVH治疗组的小鼠肿瘤消退作用更强，且对远侧的肿瘤也有更好的效果。流式分析结果显示，注射YST-OVH显著诱导IFN-γ+CD8+T细胞、IFN-γ+T-NF-α+CD8+ T细胞和GZMB+CD8+ T细胞的活化。以上结果表明 YST-OVH 可以通过激活肿瘤浸润性 CD8+ T 细胞来增强抗肿瘤功效(图4H-I)。
接下来，作者通过使用CyTOF分析 TME中的精确动力学来确定YST-OVH在抗肿瘤中发挥的免疫相关的作用。我们重点分析了T细胞亚群，当单个Marker在t-SNE图中突出显示时，指示T细胞的活化、分化以及耗竭的关键标记定位在同一位置（图5A）。PhenoGraphy对T细胞亚群的再分析，确定了10个主要的T细胞细分亚群：CD8+T细胞（T3、T4、T5、T6、T8、T9和T11）、CD4+T细胞（T2和T7）、Treg细胞（T1）和其他CD3+细胞（T10）（图5B）。
对这些T细胞簇的分析显示， OVH或YST-OVH治疗后，TME中的T细胞群发生显著变化（图5C）。在热图中显示了每个T细胞簇上24个不同标记的表达谱（图5D）。图5E显示了每个T细胞簇在整个肿瘤浸润T细胞群中的比例。值得注意的是，OVH治疗和YST-OVH治疗都导致了T细胞群体的显著变化，其中YST-OVH显著增加了杀伤性T细胞中T6和T8比例，而耗竭性T细胞中T3,T5以及T11在对照组中普遍存在，OVH治疗后显著降低，而YST-OVH则降低得更为明显，特别是T3和T11。更为重要的是，YST-OVH组中杀伤性T细胞高表达记忆性CD8+T细胞的Marker基因Ly6C，后来实验也证明瘤内注射溶瘤病毒能够诱导产生肿瘤特异性以及病毒特异性的记忆T细胞。
有趣的是YST-OVH能够诱导产生很强的肿瘤特异性记忆T细胞，而产生很弱的病毒记忆性T细胞，说明YST-OVH能够比OVH或对照组更早地影响CD8+T细胞，而且可能是通过重编程效应CD8+T细胞为记忆性T细胞，从而改变整个瘤内TME环境此外，在所有耗竭性CD8细胞群中，抑制性受体基因CTLA-4和TIM3都有高表达，然而OVH或YST-OVH对T7细胞群都没有明显的作用，说明也许通过适当的免疫检查点阻断(如抗CTLA-4或抗TIM-3治疗)来逆转T细胞衰竭和阻断活化的Treg细胞，可能能够进一步促进YST-OVH治疗的抗肿瘤作用。
为了探讨联合抗CTLA-4是否能增强YST-OVH的抗肿瘤疗效，作者在此通过动物实验进行验证。如图6B、C所示，YST-OVH，抗CTLA-4单药治疗均显著抑制两侧肿瘤的生长。此外，YST-OVH和抗CTLA-4联合治疗进一步减少了两侧肿瘤的体积，4只小鼠的注射侧肿瘤获得了完全缓解，6只小鼠的远侧肿瘤完全缓解（图6D-E）。随后比较了YST-OVH和抗TIM-3的抗肿瘤作用，均显著抑制肿瘤的生长(图5F)。这些结果表明，抗CTLA-4或抗TIM-3联合治疗进一步提高了YST-OVH的抗肿瘤疗效。通过获取治疗小鼠的肿瘤，对RNA测序数据的分析显示，一些免疫相关的信号通路，在共同治疗的肿瘤中显著富集。这些结果表明，YST-OVH和抗CTLA-4联合应用可通过提高肿瘤的免疫原性，进一步提高抗肿瘤疗效。
图 7 YST-OVH 治疗可抑制人源化小鼠的肿瘤进展，而不会诱导强烈的炎症反应最后，作者使用人源化小鼠模型测试了YST-OVH的有效性。将Huh-7人肝癌细胞皮下植入NSG小鼠中，YST-OVH显著抑制肿瘤的生长，且作用优于OVH(图7B-E)。此外，并没有观察到细胞因子升高或体重的显著变化(图7F-H)。总的来说，这些结果表明，YST-OVH显著增强了抗肿瘤疗效，并可能在人源化小鼠模型中具有良好的耐受性。通过工程化的YST-OVH 局部递送 PD-1 抑制剂是一种高效且安全的癌症免疫治疗策略。 YST-OVH 还与 CTLA-4 或 TIM-3 阻断剂协同作用以增强对癌症的免疫反应。 这些数据为进一步临床评估这种新的治疗方法提供了强有力的依据。
参考文献：
[1] Harrington K, Freeman DJ, Kelly B, et al. Optimizing oncolytic virotherapy in cancer treatment. Nat Rev Drug Discov 2019;18:689–706.
[2] Chen DS, Mellman I. Elements of cancer immunity and the cancer immune set point. Nature2017;541:321–30.
[3] Sharma P, Allison JP. The future of immune checkpoint therapy. Science 2015;348:56–61.
[4] Binnewies M, Roberts EW, Kersten K, et al. Understanding the tumor immune microenvironment (TIME) for effective therapy. Nat Med 2018;24:541–50.
[5] Bommareddy PK, Shettigar M, Kaufman HL. Integrating oncolytic viruses in combination cancer immunotherapy. Nat Rev Immunol 2018;18:498–513.